解读基因之间：单细胞分辨率下的胶质母细胞瘤全貌



历经一代人的研究进展仍难以攻克的一种癌症

胶质母细胞瘤（GBM）至今仍是多发于成年人当中最具侵略性的原发性脑肿瘤。尽管经过数十年的研究，目前已建立包括外科切除、放射治疗和替莫唑胺化疗在内的标准化治疗方案，患者的中位存活期仍只有大约 15 个月。在过去一代人的时间里，这种疾病的不良预后情况几乎没有改变，使无数患者及其家属在确诊后承受巨大的打击。

在每一个统计数据背后，都是一个有血有肉的人。因此，患者由始至终都必须是我们一切工作的核心。在临床工作中，我们常常在病人及其家人生命中最恐惧的时候与他们相遇。他们会用不同的方式提出同样的问题：你能为我做些什么？ 长久以来，那个诚实的答案都未能达到我们作为医生与科学家的期望。手术可以减少肿瘤体积，放射治疗和替莫唑胺能够推迟肿瘤的生长，但胶质母细胞瘤几乎必定会复发；而其一旦复发的话，可选择的治疗方案便会大幅减少。渐进式的医学进步已经不足够；我们必须突破当前的界限。

胶质母细胞瘤之所以如此难以治疗，主要源于两个关键特征，而理解这些特征有助于解释为何治疗进展如此艰巨。首先，每一个肿瘤都是独特的。即使在同一个肿瘤之内，细胞也会呈现出截然不同的分子特征，这种现象被称为肿瘤内异质性（intratumoural heterogeneity）。其次，胶质母细胞瘤的细胞会大幅度地重调基因的解读方式，产生扭曲的信使核糖核酸（mRNA）分子，进而生成异常或致癌蛋白质。我们称此过程为可变剪接，而其正逐渐被科学界视为对胶质母细胞瘤最具影响力却仍未被充分理解的驱动因素之一，并且在主流癌症基因组学技术中往往难以被检测出来。

在发表于《自然通讯》（Nature Communications 的新近研究中，我们尝试同时解决这两个问题。通过在单细胞分辨率下捕捉完整mRNA 分子的长读长定序技术，（逐一检视每个细胞，而非寻求数千个细胞之间的平均信号），我们着手建立至今最为全面的胶质母细胞瘤异构体图谱。此举的目标非常明确：我们要找出真正能区分病人肿瘤细胞与健康细胞的分子特征，进而发现传统方法所忽略的潜在治疗契机。在我们看来，达到这种精细度的解析，正是当前患者对我们的期望。

为何异构体这么重要？

每个人类基因在原则上都可以被剪接成多种不同的 mRNA 分子，每一种都会编码出略有差异的蛋白质。这些变异形式称为异构体（isoform）。在健康细胞里，剪接过程受到精细的调控。然而，在癌细胞里，剪接陷入混乱，产生会促进肿瘤生长、逃避免疫系统或抵抗治疗的异构体。

直到最近，癌症转录组学（cancer transcriptomics）仍然主要依赖短读长定序技术，但是这种技术只能读取mRNA分子的短片段。若要解析完整的异构体，就必须使用从头到尾读取整条 mRNA 分子的技术，进行长读长定序。在单细胞层面运用长读长定序是一项相当大的技术挑战，但此举能带来非凡的成果，让我们能够清楚观察到肿瘤中每一个细胞表达的是哪一种基因异构体。



图1：研究工作流程概览。采样自胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织被解离成单细胞，并透过两种互补的定序技术捕获并读取其中的全长RNA分子：短读长定序用于确立细胞身份，而长读长定序则用于解析每个RNA转录本的完整结构。这种结合策略使我们能够识别出肿瘤特异性RNA异构体，并提出两类具潜力的治疗契机：结合肿瘤细胞表面与细胞内标靶的适体药物，以及可开发为个人化癌症疫苗的胜肽新抗原。



建立胶质母细胞瘤的单细胞长读长定序图谱

我们使用了采集自27位于玛丽医院接受治疗的胶质母细胞瘤患者的手术样本，从超过182,000个细胞中生成了匹配的短读长与长读长单细胞RNA的测序数据。据我们所知，这建立了至今最全面的人类胶质母细胞瘤异构体多样性图谱。

我们得出了三项主要的研究成果：

  1. 肿瘤细胞中有广泛的异构体重组情况。在肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间，有近十万条mRNA转录本呈现差异性表达。值得注意的是，超过6,600个基因只会在肿瘤细胞中产生具蛋白质编码功能的异构体，而其对应的正常细胞则只产生无功能的版本。许多这类转换并未伴随任何整体基因表达的变化，意味着它们在传统分析中将完全不可见。一个显著的例子是NTRK2，它编码神经营养因子受体TrkB。在间质样状态（一种特别具侵略性的肿瘤亚型）之中，肿瘤细胞倾向于表达一种缺乏细胞内讯号传导结构域的截短型TrkB，其在先前的研究中已知能够促进胶质瘤的生长，它在基因层面几乎不可见，但在异构体层面却清晰可见。




    图2：单一基因NTRK2在胶质母细胞瘤中会产生两种截然不同的RNA异构体。全长异构体（ENST00000376213）主要存在于星形胶质细胞样的肿瘤细胞中；而缺乏细胞内讯号传导结构域的较短异构体（ENST00000359847），则主要存在于侵略性较强的间质样肿瘤细胞中。右侧的两幅图谱显示这两种异构体在肿瘤中数千个单一细胞内的表现分布情况，其中红色代表高表达。此范例说明了这项研究的一项核心发现：肿瘤细胞群体之间生物学上的重要差异，在基因层面往往是隐而未见的，唯有进行长读长定序时才会显现出来。



  2. 双重靶向精准治疗的框架。 胶质母细胞瘤治疗中面临的一大挑战在于大多数与肿瘤相关的蛋白在某种程度上也会在健康组织中表达，这使科学家难以开发能够避免伤害正常细胞的治疗方法。我们推断，具有肿瘤特异性的异构体也许能够提供一种避免此情况的途径：即使基因本身在健康细胞中也有表达，但肿瘤细胞中的特定异构体可能是独一无二的。
    基于这个概念，我们建立了一个分析框架，以识别仅存在于癌细胞中的成对肿瘤特异性异构体。表面靶点可由适体（aptamer）识别 — 适体是一种小型核酸分子，比抗体更有效地穿越血脑屏障。这开启了使用 “适体 — 药物偶联物” 作为治疗方案的可能性。这种新型疗法能同时精准标靶癌细胞并能够有效进入脑部组织，因此在脑癌治疗领域极具前景。运用这个框架后，我们在整个受试群体中识别出 40 对具有高度患者特异性的标靶组合。在 GTEx 参考图谱所收录的大约 48,000 个健康组织样本中，这些组合几乎完全不存在。

  3. 数以千计的“隐藏”异构体，以及癌症疫苗标靶的新来源。由于长读长定序技术能够完整读取mRNA，因此它能揭示在现有参考批注中完全缺失的转录本。我们在胶质母细胞瘤中鉴定出6,524个这类高可信度的新型异构体，其中179个具肿瘤特异性。




    图3：每名胶质母细胞瘤患者均携带独特的肿瘤特异性RNA异构体组合，可作为潜在治疗标靶。此处展示两位具代表性的患者，各自拥有一组不同的标靶配对：一个位于肿瘤细胞表面，另一个位于细胞内部。这组标靶几乎仅在患者的肿瘤细胞中共同表现（以红色标示），且不存在于健康细胞中。此类配对是双特异性治疗策略的理想候选者：透过结合细胞表面的适体，将基因静默剂递送至细胞内的标靶，从而在精准打击肿瘤同时又不伤及健康组织。每位患者标靶配对的独特性，凸显了未来胶质母细胞瘤治疗进行个人化设计的必要性。



我们其后提出疑问：这些只存在于肿瘤的异构体会否产生能被免疫系统辨识为“外来”物质的小分子胜肽？我们使用两种独立的预测算法，其后再以第三种算法进行验证，识别出89种异构体。这些异构体所编码的胜肽，经预测显示能与人类白血球抗原（HLA） 第一类分子产生高亲和力结合，而此分子正是免疫系统用于向 T 细胞呈现异常蛋白的分子平台。重要的是，其中有数个预测新抗原表现出比已进入肽类疫苗临床试验的知名突变衍生新抗原更为广泛、更加强大的免疫呈现能力。这对于胶质母细胞瘤来说意义尤其重大，因为这种癌症的突变负荷十分低，一直以来限制了免疫治疗的效果。因此，剪接衍生的新抗原也许代表了一个尚未开发但是十分丰富的肿瘤特异性靶点来源 — 一条充满“异质性”的“矿脉”，能够为个人化疫苗所运用。



图4：候选新抗原（源自肿瘤特异性异构体的蛋白质短片段）排序图，排序依据为它们与东亚族群最常见的五种 HLA 第一类（HLA class I）分子结合的预测能力。颜色越深代表预测的结合力越强，因而该片段被T细胞识别并用于诱发抗肿瘤免疫反应的可能性也越高。这些胜肽并不存在于正常的人体蛋白质组中，使其成为开发针对胶质母细胞瘤的个人化癌症疫苗时极具吸引力的标靶。



从病床到实验室：合作框架

这类研究高度依赖于任何单一实验室都无法独自组建的平台，而这项研究正是借助了近年在香港逐渐成熟的两大合作伙伴。

本次研究所使用的肿瘤样本由香港大学李嘉诚医学院与玛丽医院合作成立的临床神经科学联盟（CNC）提供。CNC在一个共同治理与生物样本库框架之下运作，连结神经外科医生、神经肿瘤学家、神经病理学家和转化科学家，使组织样本得以被采集、注释并提供用于研究，同时附带进行异构体层面分析所需的详细临床信息。临床神经科学联盟的脑肿瘤协作小组与港大医学院和玛丽医院的神经外科合作，协调这项研究所依赖的术中取样与临床批注工作。

定序与计算分析工作则是与香港基因组计划的执行机构 — 香港基因组中心（HKGI）合作进行。HKGI提供了让我们得以在这个规模下进行单细胞异构体分析所需的长读长定序平台与信息环境 — 这样的组合在大多数学术环境中尚不普及。我们与香港基因组中心的合作不仅限于这次研究，更涵盖了广泛地针对多种恶性肿瘤开展基因组及转录组特征描绘的计划，并以将群体规模的定序能力转化为直接惠及患者的成果为共同目标。临床服务、学术研究与公共部门基因组基础设施之间的协同，使这项研究得以实现，而这样的深度合作在国际上仍不常见。此类协作的持续性，将决定此类工作从单一研究推进到标准实践的速度。

未来展望

这项研究的结果奠定了基础，而非下了结论。目前在我们所描述的生物学与我们期望能因此受惠的病人之间，仍存在三个问题有待解答。首先，这些预测新抗原是否能在病人身上引发T细胞免疫反应？要回答这个问题，需要系统性的免疫学验证，理想情况下应纳入至早期临床试验之中。其次，经本次研究识别出来、针对病人特异性异构体对的“适体 — 药物偶联物”，能否在临床前模型中达到显著疗效，并且维持在可接受的治疗窗口？第三个问题，或许也是最难的一个问题：如何透过医院与医疗系统能够切实运行的工作流程，来实现根本性的个人化方案，亦即每位病人都携带着自己独特的靶点配对与新抗原？

我们的实验室以及直接合作伙伴已经就这三个方向展开工作。对预测新抗原的免疫原性研究、针对我们所识别的异构体对开发适体 — 药物偶联物的临床前研究，以及临床上可部署的个人化工作流程的早期设计工作，都已在同步进行，从而让一个以异构体为导向的医疗策略在生物学、化学和操作层面上得以同步而非依序地迈向成熟。我们正积极把相关工作延伸至更广阔的范畴，透过建立区域性及国际性的合作以达到这种个人化方案的最终需要。

这些都是重大的问题，但并非无先例可循。以mRNA为基础的个人化癌症疫苗在黑色素瘤及胰脏癌的临床进展迅速，意味病人专属的靶点识别、制造及施用程序，可以压缩至临床上可行的时间框架之内。适体化学在其他疾病的框架下亦同样地取得相当的进展，显示异构体导向策略的递送部分同样可望实现。过去一直缺少的，是一幅能以所需分辨率界定靶点的分子地图，而这正是本次研究所提供的价值所在。

面对胶质母细胞瘤这般凶猛的疾病，仅靠小幅度进展已不足以应对。全长单细胞转录组的解读，揭示了短读长方法从未能觉察的盲点。我们接下来的任务，是将这种盲点转化为惠及病人的实际益处，而这并不能单靠单一团队独自完成。我们期待与区域内和国际上的同仁合作，依托港大医学院、玛丽医院及香港基因组中心，在大学教育资助委员会及研究资助局的支持下，将这类成果推向临床应用。

原文

Tang, W., Lo, C.W.S. et al. Mapping glioblastoma's isoform diversity using long-read single-cell analysis. Nature Communications 17:5640 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-72258-2


作者

香港大学李嘉诚医学院临床医学学院临床肿瘤学系及癌症医学中心临床助理教授、临床神经医学联盟督导委员会成员Aya El Helali

香港基因组中心行政总裁（暂任）及首席医务及科学总监、香港大学李嘉诚医学院临床医学学院儿童及青少年科学系临床副教授钟侃言

香港大学李嘉诚医学院临床医学学院外科学系临床教授、临床神经医学联盟召集人梁嘉杰

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